Rekombinant DNA-teknik

Sammanfattning

Termen rekombinant DNA beskriver att DNA med olika ursprung har kopplats ihop. En annan överlappande term är transgenteknik som beskriver att nytt DNA förs in i en organisms celler vilket resulterar i en transgen organism. När man talar om genetiskt modifierade organismer (GMO) är det ofta transgena som åsyftas.

Anledningen till att transgenteknik fungerar är att DNA är kemiskt uppbyggt och fungerar på samma sätt hos alla levande organismer och innebär att en gen från en organism kan fungera i en annan.

Enzymer som klipper itu DNA

De komponenter som är grundläggande för rekombinant DNA-teknik är en grupp enzymer som finns hos bakterier. Precis som allt annat levande kan bakterier infekteras av virus. En del av bakteriernas antivirala försvar består av en grupp enzymer som kallas restriktionsenzymer. De har i uppgift att klippa sönder infekterande virus genetiska material (DNA eller RNA).

Under 1970-talet lärde sig forskare att utvinna och använda några av de här enzymerna för att till exempel klippa ut gener ur genomet. Varje restriktionsenzym har sitt specifika klyvningsställe. Det betyder att de känner igen ett motiv i DNA-sekvensen som det klipper fosfodiesterbindningarna vid. Idag finns hundratals olika restriktionsenzymer tillgängliga att köpa som alla har olika klyvningsställen.

Restriktionsenzymer ingår i enzymklassen nukleaser som utgörs av enzymer som alla har funktionen att klyva nukleinsyror (DNA eller RNA). Bland nukleaser finns bland annat Cas9 som används i genomredigeringstekniken CRISPR/Cas9.

Mer information finns på sidan Gensaxen CRISPR/Cas9.

Enzym som klistrar ihop DNA

När en del restriktionsenzym klyver DNA så lämnas två överhäng kvar på varje DNA-sträng. Det kallas för “klistriga ändar” (på engelska sticky ends). Andra restriktionsenzym klipper rakt av och lämnar “trubbiga ändar”, och lämpar sig inte lika bra om man vill göra rekombinant-DNA.

Om DNA från en annan biologisk källa klyvs med samma restriktionsenzym så bildas ett matchande överhäng som basparar. Blandas de två reaktionerna så uppstår möjligheten att DNA med olika ursprung kopplas ihop. Adderas också enzymet DNA-ligas till reaktionen så kan de nya kopplingarna av DNA förslutas och man har gjort en rekombinant DNA-molekyl.

DNA-ligas finns hos alla organismer eftersom det är nödvändigt för att kopiera och reparera DNA. Det DNA-ligas som används i laboratoriet har ofta isolerats från bakterier eller virus.

Med vektorer kan DNA transporteras in i celler

Vektorer är centrala verktyg inom transgenteknik och används för att transportera in nytt DNA i celler. Vilken vektor som används beror på vilken celltyp som ska ta emot DNA. För organismer med prokaryota celler (bakterier) används nästan uteslutande plasmider som vektorer. För organismer med eukaryota celler (växter, djur och svampar) är det vanligt att använda mikroinjektion eller elekroporering av plasmider eller att låta virus vara vektorer.

Plasmider är små DNA-ringar som skickas mellan bakterier

Bakterier har majoriteten av sitt DNA i en kromosom. Utöver det finns DNA även i formen av mindre ringformade DNA-molekyler som kallas plasmider. I varje plasmid finns bara plats för några få gener och de replikeras (kopieras) självständigt från det DNA som finns i kromosomen.

Speciellt med plasmider är att de kan bytas mellan bakterier. De kan till exempel skickas direkt från en bakterie till en annan via pilier (trådliknande utskott på cellytan). Bakterier kan också ta upp fritt DNA och plasmider från sin omgivning.

Med plasmider kan forskare både göra rekombinant-DNA och transportera in nytt DNA i bakterier. Om en plasmid och DNA som innehåller en gen av intresse klyvs med samma restriktionsenzym så får de matchande ändar som kopplas samman till en rekombinant plasmid. Den nya kopplingen sammanfogas med hjälp av DNA-ligas.

Om den rekombinanta plasmiden blandas med bakterier så kommer en del bakterier att ta upp den nya plasmiden. När en prokaryot bakteriecell spontant tar upp nytt DNA kallas det transformation.

De bakterier som spontant tagit upp rekombinanta plasmider kan förökas upp i syfte att utvinna protein. Om den rekombinanta plasmiden innehåller den humana genen för insulin som i bilden ovanför, så kommer de transformerade bakterierna att börja tillverka insulin. Det här är det vanligaste användningsområdet för rekombinant DNA-teknik och många proteiner som används inom läkemedels- och livsmedelsindustrin masstillverkas på det här sättet.

Mer information finns i avsnittet Genetiskt modifierade mikroorganismer (GMM).

Mikroinjektion och elektroporering

Eukaryota celler kan inte kan ta upp DNA spontant så som bakterier kan. Därför har olika tekniker utvecklats för att kunna föra in nytt DNA och genetiskt modifiera växter, djur och svampar. Processen när nytt DNA förs in i eukaryota celler kallas för transfektion.

En metod som används ofta då forskare tar fram avelslinjer av genetiskt modifierade laboratoriemöss är mikroinjektion. Då fixeras en cell under ett mikroskop och en mycket tunn glaskanyl används för att föra in en rekombinant plasmid i cellkärnan. Inne i cellkärnan integreras antingen DNA i genomet eller uttryckas transient (inte integrerat men transkriberas likt annat DNA).

Ett annat alternativ är elektroporering som innebär att en kort elektrisk puls skapar små tillfälliga öppna porer i cellmembranet där en rekombinant plasmid eller annat DNA kan slinka in. Används till exempel om det är större plasmider som ska föras in i cellen.

Även lipida nanopartiklar kan användas för att transportera rekombinanta plasmider. Det är mikroskopiska fettbubblor som lämpar sig väl för att transportera mindre molekyler. Metoden används oftare för att transportera komponenter till CRISPR/Cas9 eller mRNA-vacciner.

Bakterier och virus som vektorer

För att transportera in nytt DNA i eukaryota celler har forskare väldigt framgångsrikt kapat naturliga förmågor hos bakterier och virus. När bakterier och virus infekterar betyder det att de tar sig in i celler. Virus, och en typ av bakterie, har dessutom förmåga att integrera nytt DNA i värdcellens genom. Det är ett sätt för dem att använda värdcellens system för proteintillverkning på ett sätt som gynnar deras spridning.

Under 1980-talet lärde sig forskare att modifiera virus så att de i stället för att föra in sitt eget DNA i djurcell för in det DNA som forskaren är intresserad av. De kallas då virusvektorer eftersom de är modifierade att inte kunna spridas och orsaka sjukdom utan bara används för transport av nytt DNA. Den här metoden används till exempel vid genterapier.

Mer information finns på sidan Så fungerar genterapi.

Om det är en växtcell som ska modifieras genetiskt kan forskare även ta hjälp av jordbakterien Agrobacterium tumefaciens. Det är en bakterie som ibland kallas för “naturens egna genmodifierare” eftersom den har en speciell förmåga att infektera växter och samtidigt föra in sina gener i växtens genom. Om A. tumefaciens tagit upp en rekombinant plasmiden kommer den när den infekterar en växt att integrera rekombinant DNA i växtens genom.

Mer information finns på sidan Genetisk modifiering av växter – hur går det till?

Ett utfällbart block som ska med i skriv ut

Detta innehåll ska med!

Lägger in en extern länk här

Referenser

• Referens nr 1

• Referens nr 2